Искусственные молекулы РНК могут избирательно блокировать экспрессию бактериальных генов

Систематические исследования прокариотических и эукариотических геномов выявили огромное разнообразие молекул малых РНК. Подавляющая часть этих молекул играет регуляторную роль в различных клеточных процессах. Группа ученых из Китая представила технологию создания искусственных молекул малых РНК, способных регулировать экспрессию бактериальных генов. Предложенная методология может быть использована как для исследовательских целей, так и для подавления экспрессии нежелательных бактериальных генов, например факторов вирулентности у патогенных бактерий.

Рис. 1. Принцип ингибиторного действия асРНК. В результате транскрипции гена образуется молекула мРНК. Далее происходит комплементарное взаимодействие молекул мРНК и асРНК, в результате чего на молекуле мРНК блокируется место посадки рибосом и, соответственно, процесс синтеза белка. Образовавшийся РНК-дуплекс подвергается деградации.

За два последних десятилетия наше представление о функциях бактериальных малых РНК значительно расширилось благодаря огромному количеству работ, посвященных этим регуляторным элементам. Многие малые молекулы РНК комплементарно взаимодействуют с матричной (смысловой) РНК-мишенью (мРНК) и поэтому называются антисмысловыми РНК (асРНК). В результате такого взаимодействия образуется РНК-дуплекс — двухцепочечная форма РНК, что приводит к изменению эффективности синтеза белков с молекулы мРНК, а также отражается на ее стабильности в клетке (рис. 1). Считается, что такой механизм действия асРНК наиболее широко распространен у бактерий в природе, несмотря на то что существуют и другие.

Бактериальные асРНК представляют собой отдельный структурный класс молекул РНК длиной от 50 до 400 нуклеотидов. Они не содержат открытых рамок считывания для трансляции белков, поэтому такие молекулы называют еще некодирующими. Известно, что асРНК могут осуществлять как негативную (ингибирование), так и позитивную регуляцию (активацию). Ранее было показано, что они участвуют во многих клеточных процессах у бактерий, включая контроль качества биосинтеза белков, поддержание уровня железа в клетке, метаболизм сахаров, выживание бактериальной культуры в условиях стресса, а также регуляцию факторов вирулентности у патогенных бактерий.

Все бактериальные асРНК делятся на два подкласса — цис-кодируемые асРНК и транс-кодируемые асРНК (рис. 2). Гены цис-кодируемых асРНК, находятся на одном локусе вместе с генами мРНК-мишеней и полностью комплементарны своим мишеням. Гены же транс-кодируемых асРНК расположены на участках хромосом, отличных от мест локализации мРНК-мишеней. У транс-кодируемых асРНК, в отличие от цис-кодируемых, может не быть полной комплементарности с мРНК-мишенью, поэтому в природе они могут иметь несколько мишеней и таким образом регулировать экспрессию нескольких генов.

Рис. 2. Различия между цис- и транс-кодируемыми асРНК у бактерий. Слева: пример регуляции при помощи цис-кодируемой асРНК CopA, которая регулирует количество копий плазмидных ДНК в клетке.Справа: принцип действия транс-кодируемых асРНК на примере асРНК OxyS, которая участвует в регуляции процессов выживания бактерии в условиях стресса. Синими стрелками обозначены мРНК-мишени, красными — асРНК. Белок Hfq обозначен на схеме кольцевой структурой.

Большинство транс-кодируемых асРНК может связываться с белком Hfq (Hfq protein), который увеличивает стабильность асРНК, защищая их от деградации в клетке, а также стабильность РНК-дуплекса в целом. Этот белок является РНК-шапероном и формирует кольцевые структуры из шести молекул-мономеров (рис. 3). Известно, что данный белок может взаимодействовать с рибонуклеазой Е — главным ферментом, участвующим в утилизации молекул РНК у E. coli.

Рис. 3. Структура бактериального белка Hfq. Кольцевой гексамер белка Hfq, состоящий из шести молекул-мономеров, показан в двух ракурсах. На одном мономере выделены цветом его структурные элементы: красным отмечена альфа-спираль, синим выделены пять бета-слоев

У эукариотических организмов принцип комплементарного взаимодействия молекул РНК лежит в основе природного механизма регуляции генов — РНК-интерференции. В настоящее время РНК-интерференция стала мощным инструментом для исследования эукариот. Однако использование подобного генно-инженерного инструмента для прокариот было ограничено невысокой эффективностью его действия. И это несмотря на то, что природные асРНК были впервые обнаружены именно у бактерий — еще в 80-е годы прошлого века.

Китайские ученые предприняли попытку создания эффективного РНК-ингибитора генов бактерий. Основываясь на общих структурных характеристиках природных бактериальных асРНК, они разработали принципы конструирования искусственных асРНК (рис. 4).

Рис. 4. Схема отображает процесс создания искусственных асРНК, подробно описанный в тексте.

Искусственная молекула регуляторной асРНК должна иметь модульную структуру и включать следующие элементы: 1) область, комплементарная мРНК-мишени; 2) сайт связывания с белком Hfq; 3) Rho-независимый терминатор транскрипции. Первый структурный элемент должен быть комплементарен той части мРНК-мишени, которая содержит последовательность Шайна—Дальгарно — место посадки рибосом на мРНК для начала синтеза белковых молекул. Второй элемент обеспечивает присоединение белка Hfq, который защищает асРНК от расщепления рибонуклеазами и, соответственно, увеличивает эффективность ингибиторного действия. Третий элемент отвечает за терминацию транскрипции асРНК, благодаря чему в клетке синтезируются искусственные молекулы заданной длины. Для предотвращения нежелательной трансляции у искусственных асРНК должен отсутствовать стартовый кодон трансляции AUG.

Различные по размеру вариации комплементарного участка для выбранного гена синтезировались искусственно, а сайты связывания Hfq и терминаторы транскрипции были позаимствованы у нескольких хорошо известных природных асРНК. В результате случайной сборки всех трех структурных частей получался целый набор искусственных асРНК. Биоинформационный анализ пространственной структуры полученных образцов позволил предварительно отобрать из них наиболее перспективные. Эти асРНК вводились в бактериальные клетки при помощи специальных экспрессионных векторов (плазмидных ДНК), и оценивалась их эффективность в блокировании мРНК гена-мишени.

Для отработки условий получения искусственных асРНК и проверки эффективности их действия авторы использовали в качестве мишени EGFP-ген, удобный тем, что уровень его экспрессии можно оценить по интенсивности свечения кодируемого им зеленого флуоресцирующего белка. Кроме того, действие искусственных асРНК было проверено на одном из природных генов E. coli (рис. 5).

Рис. 5. Ингибирование генной экспрессии в E. coli при помощи искусственных асРНК. А и Б — эффект действия разных искусственных асРНК на EGFP-ген (асРНК GY1-GY6) и на природный ген бактерии uidA (асРНК CY1-CY10) соответственно. В и Г — определение размера полученных искусственных асРНК. Длина искусственных молекул не превышает 100 нуклеотидов. 

В итоге была отработана технология создания искусственных транс-кодируемых асРНК, которые ингибировали в несколько раз экспрессию бактериальных генов за счет комплементарного взаимодействия с мРНК-мишенью. При этом авторы отмечают, что ключевой стадией действия искусственных асРНК является уменьшение эффективности синтеза белковых молекул.

В ходе исследования выяснилось, что оптимальная длина искусственных асРНК не превышает 100 нуклеотидов. Анализ результатов показал, что для эффективного действия искусственных асРНК наиболее важны два их структурных элемента: область, комплементарная мРНК-мишени, и сайт связывания Hfq. Также эффективность действия искусственных асРНК зависит от их вторичной структуры и кинетики связывания (скорость и сила) с молекулами мРНК-мишенями. Очень важно, чтобы во вторичной структуре искусственных асРНК образовывалось несколько шпилек (stem-loop), в частности важен размер петель у шпилек (рис. 6).

Рис. 6. Влияние элементов вторичной структуры искусственных асРНК на эффективность ингибирования. А и Б. Изменение вторичной структуры у асРНК с мутациями-заменами нуклеотидов L-CY4 (исходная молекула CY4); L-CY6 (исходная молекула CY6), а также ряда форм асРНК CY9 влечет изменение эффективности ингибиторного действия на природный ген E. coli

Искусственные молекулы асРНК, полученные в ходе этого исследования, могут подавлять экспрессию генов-мишеней в 4–7 раз, но даже эта эффективность действия дает много преимуществ перед тривиальными методами воздействия на гены бактерий, такими как гомологичная рекомбинация или транспозоновый мутагенез. В частности, введение асРНК при помощи плазмидных векторов позволяет регулировать дозу асРНК в клетке. А использование принципа транс-кодируемых асРНК, в отличие от цис-кодируемых асРНК, позволило увеличить время жизни искусственных асРНК в клетке с 5 до 10 минут и более. Этого удалось добиться во многом благодаря защитному действию белка Hfq.

Достигнуть эффективности природных асРНК пока не удалось, но авторы данного исследования планируют продолжить работу по оптимизации своей методики. Китайские ученые надеются, что искусственные асРНК станут хорошим альтернативным способом нокаутировать бактериальные гены, а также могут быть использованы для подавления экспрессии факторов вирулентности у патогенных бактерий, играя роль антибиотиков.

По материалам www.elementy.ru

Поступить в МТИ